Cell突破丨李栋组开发新型超分辨成像技术揭示细胞器互作新现象——专家解读点评

解读丨刘艳、钟桂生（上海科技大学生命学院）

点评丨朱学良（中科院上海生化细胞所）

责编丨迦溆

光学显微镜在生命科学研究中发挥至关重要的作用。近年来光学成像研究技术突飞猛进，人们的终极目标是希望对活细胞实现实时、无损、高清的成像研究。

虽然传统的宽场荧光成像速度足够快，但是它具有失焦背景，这很容易掩盖发生在细胞器细胞上的事件。全内反射荧光（Total internal reflection fluorescence，TIRF）显微术消除了这种背景，但它只能在距离基底膜100nm以内成像（Steyer and Almers，2001），因为距离太小而不能跨越许多细胞器及其细胞器接触部位。旋转转盘共聚焦显微镜（ Spinning-disk confocal microscopy，SDCM）消除失焦背景和对基底膜的限制，但以大量光漂白和降低速度为代价：在以前的SDCM细胞器相互作用动力学研究中(Friedman et.al，2011；Rowland et.al，2014)，成像速度被限制在2到5秒/帧，持续时间为2分钟。所有这些方法共同的另一个问题是，它们受到衍射限制到200纳米左右的横向分辨率。为了更清楚地了解潜在的细胞器接触，我们必须转向超分辨率（SR）荧光显微镜。

结构光照明荧光超高分辨率显微镜（SIM, Structured illumination microscopy）在活细胞成像中具有较大的优势。普通的宽场2D SIM（Gustafsson, 2000）易受焦外背景影响，活体细胞TIRF—SIM分辨率高，成像速度快（高达3.7帧/秒），但只能采集到紧贴盖玻片的很薄一层。然而，大多数的细胞器的相互作用都在TIRF光照范围之外。因此开发出一种成像技术，具有较高的时间-空间分辨率，低光漂白和光毒性，能实时无创地监测活细胞内如内质网这样的特定细胞器，追踪其快速、并持续数分钟的重新排列过程，会对很多传统的细胞生物学课题的研究具有较大的推动作用。

10月25日，中国科学院生物物理研究所李栋课题组与美国霍华德休斯医学研究所Eric Betzig博士、Jennifer Lippincott-Schwartz博士合作在Cell杂志发表了题为Visualizing intracellular organelle and cytoskeletal interactions at nanoscale resolution on millisecond timescales的论文，详细介绍了一种观测细胞内动态过程的新技术——掠入射-结构光照明超高分辨率显微成像技术（GI-SIM, Grazing Incidence Structured Illumination Microscopy），该技术克服了全内反射荧光成像（TIRF）的成像深度局限，实现了快速（266帧/秒）、高分辨率（97-nm）的活细胞超分辨成像，为解析细胞中细胞器（内质网、线粒体等）膜相互作用及微管功能的研究提供了新的洞见。

在真核细胞中，细胞器与细胞骨架实时发生高度动态、同时又被严密调控的相互作用，以协调复杂的细胞功能。观测这些动态过程，需要对细胞的内部环境进行非侵入性的、长时程的成像，并要求成像技术应具备非常高的时-空分辨率，以及很低的成像背景。为达到这些通常情况下相互矛盾的目标，李栋课题组等发展了掠入射-结构光照明超高分辨率显微成像技术（GI-SIM, Grazing Incidence Structured Illumination Microscopy）这种新的成像方法。该方法能够突破现有技术局限，对细胞基底膜附近的动态过程以97nm分辨率，266帧/秒的速度，进行超过数千时间点的持续成像。

图1. 比较TIRF, WF, GI SIM的照明方式(A). 由全内反射(TIRF)产生的倏逝波光场呈指数衰减的轴向强度剖面，这限制了它的光照深度在质膜附近。因此，在相应的长程结构照明显微镜下只能看到ER网络的碎片。(B). 传统的宽视场(WF)模式照亮整个细胞体积，这样对焦结构如皮质ER被对焦背景遮挡。(C). 临界入射(GI)产生的薄层厚度与聚焦深度匹配(DOF)的高数值孔径目的是照亮整个体积的基底细胞皮层，包括皮质ER网络，在相应的GI-SIM图像中有最小的失焦背景。

利用多色GI-SIM技术，李栋课题组研究了多种细胞器与细胞骨架的快速动态相互作用，为人们提供了对这些结构之间复杂行为的新认识。精确测量微管生长或者收缩事件有助于区分微管动态不稳定性模型。分析内质网与其它细胞器或者微管的相互作用，揭示了新的内质网重塑机制（微管解聚端牵引、搭便车和微管非依赖三种管状内质网延伸方式）；研究还发现了内质网-线粒体接触点能够促进线粒体的分裂与融合（约60%的线粒体融合事件发生在线粒体与内质网的接触位点，并且与内质网接触的线粒体融合事件通常快于那些没有与内质网接触的融合事件）；首次观测到处于运动状态的溶酶体可引起管状内质网的瞬时断裂；首次在哺乳动物细胞中证实不同种细胞器间存在广泛的“搭便车”（Hitchhiking）互作现象，并观测到线粒体、内质网等细胞器的形态改变和迁移可通过搭载到其它正在运动的细胞器上实现，而无需其直接招募马达蛋白。

图2. GI-SIM能快速揭示MTs和ER网络的动态不稳定性。图中显示沿内质网小管的子域随时间变化的延时SIM图像。青色和橙色箭头表示两个收缩部位的形成和消失。在7.5 ms时，这些子域在GI-SIM图像(左)中得到了很好的解析，但在衍射受限的GI图像(右)中却无法清晰地观察到。

图3. 管状内质网的形成机理(A). 在活性COS-7细胞中内质网网络(洋红色)重排对MTs(绿色)的依赖(可参考视频S2. 第一部分)；(B). 管状ER产生滑动机制的延时成像。

图4. 管状内质网在线粒体分裂融合中的作用。(C). 内质网-线粒体接触点的典型线粒体分裂过程的延时图像； (D). 内质网-线粒体接触点的典型线粒体融合过程的延时图像。

图5. 内质网相互作用调节了内体或溶酶体的运输。(A). 在COS-7细胞中，微管(黄色)、内质网 (洋红色)和内体或溶酶体(绿色)相互作用的全视场图像； (B). 延时图像说明内质网多边形自发收缩到内体或溶酶体大小的过程。

技术展望：

GI-SIM提供了超高分辨率、高速、多色成像，以及低光漂白、低光毒性的组合优势，因而非常适合于细胞内动态生命过程的研究。与TIRF或TIRF-SIM相比，GI-SIM技术能够探测到的样品深度能达到上述技术的大约10倍；并能获得比之前强10倍的荧光信号。与SDCM相比，GI-SIM的空间分辨率显著提高2倍，成像速度也显著提高近10倍；与其它的超高分辨率方法相比，GI-SIM在时间-空间分辨率上取得了更好的平衡，并具备低光漂白及光毒性特征，实现在细胞大小的视场中进行活细胞成像。此外，荧光基团的光物理性质的持续提升，也将为GI-SIM技术获得超过97nm分辨率与266帧/秒成像速度的性能提升提供进一步的保证。

GI-SIM技术仍具备进一步提升改进的可能性。李栋课题组报道的GI-SIM技术，其成像速度高达266帧/秒/颜色，高于许多成对的细胞器相互作用研究需要的速度。若结合近期发展的谱分解方法，进行高光谱超高分辨率成像，可为6个或者更多细胞器多方相互作用的同期实时成像研究提供可能性。此外，目前GI-SIM是一种严格的2D技术，通过多NA激发，并辅以更多的原始图像数据，有可能实现对活细胞基底膜附近动态过程的3D解析。

李东课题组发展的GI-SIM方法，提供了获得超高时-空分辨率，以及对活细胞产生最小损伤性的成像途径，满足了对活细胞开展细胞内动态成像的需求。该技术具有广泛的应用前景，为研究体外培养细胞，或者对组织边缘细胞内极为微小，并且高度动态的相互作用过程，打开了一个新窗口。我们期待以后随着技术的革新，开发出更高空间分辨率和时间分辨率的成像方法，可以用来观测活细胞或者组织中的分子的动态变化过程。

（注：解读专家钟桂生博士为哈佛大学庄小威教授的博后，现为上海科技大学生命学院PI，主要从事超分辨显微成像结合神经生物学的相关研究。）

专家点评

朱学良（中科院上海生化与细胞研究所研究员、细胞生物学国家重点实验室主任、杰青）

2018年10月25日，Cell杂志在线发表了中国科学院生物物理所李栋研究员等发表的论文“Visualizing intracellular organelle and cytoskeletal interactions at nanoscale resolution on millisecond timescales”，报道了一种新的超分辨荧光显微镜和以此在活细胞中做出的最新研究发现【1】。

细胞不仅是地球上所有生物的最小单位，也是人类所认识的宇宙中最为精巧复杂的单元，而显微成像设备的性能是解析细胞精细结构和运作机理的一个关键限制因素【2】。荧光显微镜能被用来直接观察或了解细胞内特定分子（如某种或几种蛋白质）或亚细胞结构的定位、分布、形态和变化等情况，因此一直是生命科学研究的利器【3-5】。但是，这类光学显微镜也有一个明显的缺点，就是其理论分辨率仅为200纳米左右（1纳米等于百万分之一毫米）。由于大多数亚细胞结构的径向尺寸都远小于200纳米，它们在光学显微镜下所呈现的只是细节有限的虚化图像。这使得相关研究人员长期以来如同一群近视者，只能在模糊不清中探寻细胞世界的奥秘。可喜的是，近年出现的超分辨显微镜（super-resolution microscope）或称显纳镜(nanoscope)（专家解读丨庄小威组在Science总结超分辨显微成像技术），突破了看似无法逾越的分辨率屏障【6】。尽管目前的技术只能使分辨率提高1到数倍，但已经能展示出以前难以甚至无法区分的细节，先驱者们因此获得2014年诺贝尔奖。但最初的超分辨显微术在提升空间分辨率的同时却牺牲了时间分辨率，难以展示活细胞内高度动态的变化。而且，其中成像速度较快的，如STED（受激发射损耗）显微术和SIM（结构光照明显微术），需要的激发光强度很高，不仅容易淬灭荧光，还会对活细胞产生较强的光毒性。因此，如何在尽量提高空间分辨率的同时快速、持续地给细胞成像，是具有挑战性的迫切需求。

2015年，在美国霍华德休斯医学研究所做博士后的李栋在Science杂志发表论文【7】，报道他和同事利用高数值孔径物镜等搭建出的全内反射荧光-结构光照明显微镜（TIRF-SIM），能在活细胞中以每秒10幅（即10Hz）的成像速度和最高84纳米分辨率持续采集数百幅双色荧光图像；利用光控荧光蛋白李栋进一步发展了非线性结构光显微术，能够以45到62纳米分辨率采集20多幅图像。利用这一装置，他们展示了活细胞中微丝网络和膜细胞器更为清晰的形态、变化和空间关系，并捕捉到细胞内吞（endocytosis）的详细过程。今年6月年，北京大学的陈良怡和华中科技大学的谭山两位教授的研究组合作在Nature Biotechnology上报道（Nat Biotech | 陈良怡、谭山合作团队发明超灵敏海森结构光超高分辨率显微镜——徐平勇点评）【8】，他们发展的海森（Hessian）算法可大大降低TIRF-SIM所需激发光的强度，在88纳米分辨率时实现了188Hz、每幅曝光时间0.2毫秒的图像采集速度，并能以97Hz的速度对外泌囊泡这样的点状结构连续成像10分钟。他们以此装置追踪了活细胞内快速运动的微管末端和囊泡、观察到不同的分泌囊泡与细胞质膜快速融合的详细过程，以及线粒体的精美结构和动态变化。

李栋博士2015年回国加盟生物物理研究所后即致力于发展超分辨活体显微成像技术。在这次发表的Cell论文中【1】，他和实验室研究人员及其国内外合作者创造性地将全内反射的激发方式微调为“掠射”（grazing incidence）方式。这样不仅大大提升了激发效率，还将成像深度由TIRF-SIM的100纳米提高了约10倍，从而可以探测更深处的亚细胞结构，如内质网。而且，这种掠射式结构光照明显微镜（GI-SIM）在优化了物镜数值孔径等参数后，能以97纳米的分辨率和266Hz的成像速度连续采集数千幅图像，不仅能清晰展示内质网、线粒体、溶酶体、内吞体等膜细胞器和微管骨架的形态及细微的动态变化，而且捕捉到它们之间令人惊奇的相互作用和相互影响的过程，如微管和沿微管运动的内吞体或溶酶体如何帮助重构管状内质网，后者又如何介导线粒体的融合与分裂等，为各种膜细胞器之间及其与细胞骨架之间的复杂关系提供了范例和新知识。

工欲善其事，必先利其器。尽管在条件简陋时科研人员也从未停止过前行的步伐，但新技术的出现总对生命科学研究发挥巨大的促进作用，甚至导致认识的飞跃。由于显微设备的商品化和普及时间周期较长，GI-SIM和Hessian-SIM这样的尖端显微镜可为细胞研究者，尤其是国内的研究者，提供难得的先机。

参考文献：

1. Guo, Y., et al., Visualizing intracellular organelle and cytoskeletal interactions at nanoscale resolution on millisecond timescales. Cell, 2018.

2. Zhu, X.L., Seeing the Yin and Yang in Cell Biology. Molecular Biology of the Cell, 2010. 21(22): p. 3827-3828.

3. Stephens, D.J. and V.J. Allan, Light microscopy techniques for live cell imaging. Science, 2003. 300(5616): p. 82-6.

4. Weijer, C.J., Visualizing signals moving in cells. Science, 2003. 300(5616): p. 96-100.

5. Yuste, R., Fluorescence microscopy today. Nat Methods, 2005. 2(12): p. 902-4.

6. Chi, K.R., Super-resolution microscopy: breaking the limits. Nature Methods 2009. 6: p. 15-18.

7. Li, D., et al., ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science, 2015. 349(6251): p. aab3500.

8. Huang, X., et al., Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nat Biotechnol, 2018. 36(5): p. 451-459.

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